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口腔灭菌现阶段采用那种技术

作者:    时间:2019-09-29    浏览次数:1

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等离子体是离子化的气体,作为物质存在的第四种状态,由电子、离子及处于基态和激发态的中性粒子组成。按等离子体焰温度,可将其分为高温等离子体和低温等离子体,低温等离子体又可分为热等离子体和冷等离子体2种。冷等离子体处于非热平衡状态,虽然电子温度较高(103~104K),但中性粒子和离子的温度及气体温度均远低于电子的温度,因此其应用时温度可低于103K。低温等离子体在不同气压下均可发生,常压等离子体直接在大气压开放环境条件下产生和应用,其放电的局部效应显著,且摆脱了真空条件的限制,简化了等离子体源产生设备,因而操作方便、高效,极大的拓展了等离子体的应用领域。
目前,冷常压等离子体在口腔医学领域已获得了比较广泛的应用。冷常压等离子体可促进粘接剂渗入软化脱矿的牙本质,增强复合树脂及自酸蚀粘接剂的聚合,提高粘接质量;还可增加印模材的表面湿润性,用以提高口腔内结构印模的精准度。作为表面改性的一种方式,冷常压等离子体也可通过改善种植体表面的亲水性促进种植体的骨结合。此外,冷常压等离子体也可直接应用于口腔科器械、修复模型及设备的消毒、种植体的表面去污、根管消毒、菌斑的清除及牙齿漂白等方面。本文主要就冷常压等离子体在消毒灭菌方面的作用特点、作用机制及其对常见口腔致病微生物的杀灭作用做一综述。
1.冷常压等离子体消毒灭菌的作用特点及优势
1.1冷常压等离子体消毒灭菌的作用特点
冷常压等离子体对微生物的消毒灭菌效果受其本身放电条件、作用时间和剂量等因素影响。影响冷常压等离子体放电的因素包括:所用工作气体的性质、组成、压力和流量,放电容器的结构和尺寸,施加的电场频率等。其中,冷常压等离子体放电使用的工作气体包括惰性气体(氦气、氩气等)、氮气、氦氧混合气和空气等,单一种类的稀有气体主要起辅助放电作用,而大部分研究表明,使用混合气体灭菌的效果往往好于单一中性气体;当工作气体中混有较低比例的O2时,可在维持等离子体稳定性的同时大幅提高其灭菌效率。冷常压等离子体对细菌表面的破坏作用具有时间依赖性,随着时间增加灭菌效果逐渐增强。
等离子体剂量对其作用效果也有很大影响:(1)低剂量等离子体(<1J/cm2)在灭活细菌的同时能保证正常细胞的存活;(2)中间剂量等离子体(1~6J/cm2)会造成可修复的DNA损伤,促进细胞释放生长因子,加快细胞增殖和迁移,控制肿瘤细胞凋亡的发展;(3)高剂量等离子体(7~10J/cm2)可使正常细胞死亡;(4)在极高剂量等离子体(>10J/cm2)的处理下,细胞将坏死。此外,处理对象的种类和浓度也影响着等离子体灭菌的效果。冷常压等离子体对革兰阴性菌的杀灭作用强于细胞壁结构更坚韧的革兰阳性菌,且冷常压等离子体对低浓度细菌的杀灭作用强于高浓度者。
1.2冷常压等离子体消毒灭菌的优势
冷常压等离子体的气体温度和压强与周围环境相近,可在大气压环境中直接应用于热敏感材料及活体组织表面的灭菌,这使其成为生物医学领域中杀菌最常使用的等离子体。冷常压等离子体消毒灭菌具有无热损伤、无毒物残留、反应速度快等优点,并可在不损害宿主细胞的情况下选择性的产生灭菌效应。此外,各种便携的手持等离子体设备可顺利进入口腔,并能很好地适应腔隙内部等复杂结构表面的处理需求,因此,可有效清理患牙内部不规则结构和狭窄通道。
2.冷常压等离子体的活性组分及其消毒灭菌的作用机制
冷常压等离子体的灭菌机制与其中所含的丰富组分密切相关,包括化学活性粒子(活性氧和活性氮等)、带电粒子(电子、正负离子等)、紫外线、一些处于激发态和亚稳态离子、电子以及电磁场等。在等离子体持续作用的时间里,这些活性组分会显著改变微生物表面,带电粒子在电场的作用下快速撞击细胞表层,使得分子间氢键断裂,破坏细胞外部膜的完整性,导致钾、核酸和蛋白质的泄漏,同时大量的活性粒子快速渗透,进入细胞内部,进一步损伤胞内成分(ATP、核酸、蛋白质),最终细胞部分或全部裂解,从而发挥等离子体的消毒灭菌作用。
2.1活性氧和活性氮
冷常压等离子体组分中,直接撞击样品或生物体的化学活性粒子主要包括活性氧粒子(O3、活化的O、O2、OH、HO2和H2O2等)和活性氮粒子(N2O/HNO2、NO3/HNO3、HNO2、NO、NO2和N2O5等)。大多数学者认为,活性氧粒子在细菌失活过程中起关键作用,活性氧粒子可使细胞壁键肽聚糖结构中的重要键发生断裂,并对DNA、脂质和蛋白质等细胞生物大分子产生氧化作用,导致细胞膜去极化、脂质过氧化以及DNA损伤,扰乱细胞的功能,使细胞膜脱水、溶解,最终直接或间接地导致细胞死亡。
也有学者认为,高反应性的OH自由基本身可能并未在细菌失活过程中起关键作用,但两个极性OH自由基在放电中心的重组产物H2O2分子,可能比较容易通过细胞膜并随后产生杀灭细菌的效应。此外,易溶于水的OH自由基可改变溶液的pH值,间接影响细菌活性。
2.2带电粒子
冷常压等离子体所产生的带电粒子介导的电物理过程在灭菌环节中起着必要的作用。带电粒子对细菌的破坏可能是由其对细胞外膜的静电干扰作用引起的,在等离子体的所有组分中,带电粒子最先达到处理目标表面并与之直接接触,随后在其细胞外膜的表面积聚,带电粒子所产生的静电力可克服细胞外膜的拉伸强度并导致其破裂。此外,带电粒子也可在活性氧对磷脂和多糖的过氧化反应过程中起催化作用。
2.3紫外线
关于冷常压等离子体放电产生的紫外线的消毒灭菌作用仍无定论,许多研究认为冷常压等离子体中紫外线的灭菌作用非常微弱。真空等离子体在极低电压下放电产生的紫外线具有消毒能力(200~290nm),而在大气压下并不能产生有足够灭菌能力的紫外波长。尽管并未观察到冷常压等离子体中紫外线对细菌的单独作用,但仍有学者认为,紫外光子和氧原子可能存在协同作用,它们与细菌之间也可产生相互作用,这些作用参与构成全方位杀灭微生物的环境。因此,紫外线的作用仍不应被完全忽视。
3.冷常压等离子体对常见口腔致病微生物的杀灭作用
3.1变形链球菌
变形链球菌是一种高度产酸的革兰阳性兼性厌氧菌,也是决定龋病发生和发展的最为重要的致龋菌。Blumhagen等用氩气等离子体刷对接种于牙釉质类似物上的变形链球菌进行处理,在13s内可将低浓度细菌(<1.7×107CFU/cm2)完全杀灭。Abonti等应用氧气作为冷常压等离子体射流的工作气体处理变形链球菌时,获得了比其他工作气体更好的杀菌效果,快速有效地杀灭了变形链球菌。Nam等则尝试将冷常压等离子体作为化学药物治疗的辅助疗法,与化学药物单独使用相比,冷常压等离子体与15%过氧化尿素联合使用显著减少了牙釉质表面黏附的变形链球菌。
冷常压等离子体处理后,变形链球菌的细胞大小和形态有显著改变,细胞壁有明显的损伤,细胞液外漏并产生细胞碎片。说明等离子体通过对变形链球菌细胞表面的蚀刻破坏细胞壁,从而发挥对变形链球菌的杀灭作用。
3.2牙龈卟啉单胞菌
牙龈卟啉单胞菌是一种革兰阴性的无芽孢多形性专性厌氧杆菌,与慢性牙周炎、局限性侵袭性牙周炎、牙周脓肿密切相关,也存在于患种植体周围炎的种植体周菌斑中。牙龈卟啉单胞菌细胞从外向内的细胞外膜、细胞壁肽聚糖层和细胞质膜的多层复杂结构决定了其抗等离子体的能力强于其他革兰阴性菌。学者们用氩氧等离子体对比格犬口内建立的种植体周围炎模型、体外牙龈卟啉单胞菌浮游菌及生物膜进行处理后,牙龈卟啉单胞菌均显著减少;利用氦气等离子体对游离菌进行处理时,等离子体直接辐射的范围内几乎无细菌存活。除此之外,氦氧等离子体也对牙龈卟啉单胞菌生物膜显示出很好的穿透能力。
冷常压等离子体对牙龈卟啉单胞菌的作用,首先是破坏其细胞壁及细胞膜,随处理时间的延长,细胞质外溢,遗传物质受损。最终扫描电镜结果显示,牙龈卟啉单胞菌菌体破碎萎缩或形成碎片,细胞膜扭曲破坏,细胞结构的完整性消失,从而被彻底杀灭。
3.3白色念珠菌
白色念珠菌是一种常见于黏膜层的共生酵母菌,是假膜型和红斑型念珠菌病的致病菌,可在义齿上定植而导致义齿性口炎,此外,也常出现在种植体周围感染的炎症组织中。使用过氧化物、次氯酸盐或二葡萄糖酸氯己定(chlorhexidine digluconate,CHX)等化学消毒剂浸泡义齿是目前控制白色念珠菌的首选方法,但灭菌效果十分有限。因此,许多学者选用了氩氧等离子体处理白色念珠菌生物膜并与传统化学消毒剂进行对比,结果均显示,等离子体处理效果优于CHX和次氯酸盐等化学消毒剂。有学者分析表明,等离子体以剂量依赖的方式有效抑制白色念珠菌的生长因子和毒力因子的作用并抑制白色念珠菌生物膜的形成。
3.4粪肠球菌
粪肠球菌是一种兼性厌氧的革兰阳性菌,也是根管治疗失败的主要影响因素,在持续的根尖病变或根管再治疗的病例中出现。研究显示,冷常压等离子体对体外粪肠球菌生物膜和感染的根管中粪肠球菌均有良好的杀灭效果,其效果可达到甚至优于Ca(OH)2或CHX等传统化学消毒剂。Herbst等研究发现,用冷常压等离子体辅助CHX可提高对粪肠球菌的杀灭效率,对高度感染的根管有很好的杀菌效果。Chang等使用介质阻挡放电等离子体处理粪肠球菌,在2min内即使粪肠球菌细胞减少了90%,达到有效灭菌。
扫描电镜显示,等离子体处理后的粪肠球菌细胞萎缩、破裂,甚至裂解为细胞碎片。这说明与对其他菌种的作用相似,等离子体破坏粪肠球菌外层结构后,其胞内遗传物质流出或化学活性粒子直接破坏其遗传物质,导致粪肠球菌死亡。
3.5生物膜
生物膜是牢固附着于某一表面,并嵌入多糖和蛋白质基质的混合物种微生物群落。口腔细菌在软硬组织表面形成的生物膜,与龋病、牙周病等几种口腔最常见的疾病的发生发展息息相关。存在于口腔内修复体及种植体表面的菌斑生物膜,也可引起口腔黏膜疾病及种植体周围炎、种植体周围黏膜炎,进而影响口腔黏膜和种植体的健康。义齿表面通常有真菌和细菌联合定植,其中白色念珠菌和金黄色葡萄球菌叠加感染会增加口腔局部感染的发生频率及严重程度。Delben等利用氩气冷常压等离子体对上述2种混合菌生物膜进行处理,白色念珠菌和金黄色葡萄球菌数量均显著减少,杀菌效果与氟康唑等传统化学药物疗效无显著性差异。
Liu等用氩氧等离子体刷对口腔生物膜中十分常见的变形链球菌和血链球菌的单一及混合细菌生物膜进行处理,结果显示等离子体处理2min即可使变异链球菌和血链球菌的存活率下降99%以上。Jablonowski等则用氩氧等离子体直接处理离体牙表面自然生长的生物膜,获得了与声波机械处理类似甚至更好的杀菌效果。
在针对生物膜的作用过程中,冷常压等离子体除了能改变微生物个体形态,造成细胞壁及膜结构大量穿孔外,也对生物膜的三维结构产生破坏。等离子体处理后的菌斑生物膜基质遭到破坏,立体结构受损变得扁平。扫描电镜也显示,等离子体可除去机械处理难以清除的牙釉质表面的蛋白玷污层,且使细菌的共聚能力降低。因此,冷常压等离子体对生物膜也有良好的清除作用。
4.等离子体活化液体在口腔消毒灭菌方面的应用
除了许多研究已证实的冷常压等离子体直接应用以灭活口腔常见病原体外,Ercan等也首次将等离子体处理的简单化学溶液(葡萄糖、半胱氨酸和肝素等)用作表面消毒剂,抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌等细菌生物膜的形成。由于其可直接椅旁使用而不需要特殊设备,等离子体活化液体被研究者们视为一种新型抗菌漱口水而做进一步研究。Li等利用等离子体活化水处理变形链球菌、黏性放线菌和牙龈卟啉单胞菌,40~60s内可获得显著的杀菌效果。
Tasaki等应用冷常压等离子体活化水处理感染牙本质模型10s即可灭活几乎全部的变形链球菌,其灭菌效果比冷等离子体射流直接处理感染牙本质180s更加可靠。等离子体活化液体中产生的活性氧,特别O、OH和H2O2,引起了强烈的氧化应激和细胞损伤,并最终杀灭细菌。
5.冷常压等离子体的缺陷
冷常压等离子体可很好的适应口腔环境,但同时也存在一定的缺陷。Blumhagen等研究表明,冷常压等离子体对高浓度细菌处理后,上层细菌残留的细胞碎片会降低等离子体对底层细菌的灭活效率。Moisan等和Kvam等也认为,冷常压等离子体作用局限于表面,微生物表面覆盖的材料甚至水都会削弱其杀菌性能,增加杀菌所需的时间。因此,在冷常压等离子体今后的应用中,需清除表面杂质,并对生物膜的厚度加以控制。冷常压等离子体目前已应用于生物材料的表面改性、医疗设备的消毒及牙齿美白等方面,并取得了显著成效。
鉴于冷常压等离子体无热损伤、无毒物残留、反应速度快及便携等优点,及其对口腔常见疾病致病菌及生物膜的良好杀灭效果,未来可单独或作为辅助方法应用于口腔软组织、根管内部及种植体周围组织的消毒灭菌。此外,离子体活化液体作为新型抗菌漱口水也获得了明确的杀菌效果。但在应用过程中,仍需注意控制处理对象的表面杂质和生物膜厚度。
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